13. oktoobril kell 10.15 kaitseb Sofia Raquel Alves Oliveira tehnika ja tehnoloogia doktoriõppekava biomeditsiini tehnoloogia erialal doktoritööd „HPLC analysis of bacterial alarmone nucleotide (p)ppGpp and its toxic analogue ppApp“ („HPLC põhine regulaatornukleotiidide (p)ppGpp ja ppApp tasemete analüüs bakterirakus“)
Juhendajad:
professor Tanel Tenson, Tartu Ülikool
vanemteadur Vasili Hauryliuk, Tartu Ülikool
Oponent:
professor Jörg Stülke (Dr. habil./PD) Göttingeni Georg-Augusti Ülikool (Saksamaa)
Kokkuvõte
Bakteritel on evolutsiooni käigus välja kujunenud arvukalt kohanemismehhanisme, mis aitavad neil ellu jääda ka karmides keskkonnatingimustes. Keerukad molekulaarsed võrgustikud kontrollivad adaptiivseid füsioloogilisi vastuseid, näiteks antibiootikumiresistentsust, biokile moodustumist ja bakterite minekut uinunud olekusse. Sellised kohanemismehhanismid sõltuvad stressi tajuvate ja sellele reageerivate valkude ensümaatilistest aktiivsustest. Üheks oluliseks komponendiks stressivastuses on signaalmolekulide süntees ja lagundamine. Käesolevas töös uuriti ühte kõige laiemalt levinud adaptiivset mehhanismi, mida nimetatakse poomisvastuseks. Selle mehhanismi puhul on võtmetähtsusega RelA / SpoT homoloogsed (RSH) ensüümid, mis sünteesivad ja lagundavad alarmoon-nukleotiide ppGpp ja ppp(G)pp. Nende nukleotiidide ühiseks nimetamiseks kasutatakse tähistust (p)ppGpp. Need molekulid mõjutavad mitmeid protsesse bakterirakus, näiteks virulentsust ja antibiootikumitolerantsust. Käesoleva töö eesmärgiks oli välja töötada metoodika nukleotiidide, sealhulgas (p)ppGpp, tasemete kvantifitseerimiseks. Rakendades seda metoodikat uuriti nukleotiidide taset bakterite kasvul ning antibiootikumitöötluse käigus.
Nukleotiidide, sealhulgas (p)ppGpp taseme kvantifitseerimiseks töötati välja HPLC-l põhinev meetod. Nukleotiidide kvantifitseerimise meetodid sisaldavad kolme etappi: proovi kogumine, nukleotiidide ekstraheerimine ja kvantifitseerimine. Kogumisetapis filtreeriti bakterikultuur ja nukleotiidide ekstraheerimiseks viidi filter äädikhappesse. (p)ppGpp kvantifitseerimiseks rakendati HPLC metoodikat 5 µm 4,6 x 150 mm tugeval anioonvahetuskolonnil. Teiste nukleotiidide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati ioon-paar pöördfaasi (IPRP) kromatograafiat Kinetex C18 2,6 µm 4,6 x 150 mm kolonnil. Kasutades väljatöötatud metoodikaid uuriti nukleotiidide tasemete muutust bakterite stressivastuse korral. Soolekepikesel (Escherichia coli) analüüsiti nukleotiidide tasemeid kasvukõvera erinevates faasides ja aminohapete nälja puhul. Aminohapete nälja puhul täheldati kiiret (p)ppGpp taseme tõusu.
Translatsiooni inhibeerivate antibiootikumide (tiostreptooni, klooramfenikooli ja tetratsükliini) mõju (p)ppGpp ja teiste nukleotiidide tasemetele bakterirakus uuriti nii Gram-negatiivsetes kui ka Gram-positiivsetes bakterites, esindajateks vastavalt E.coli ja Bacillus subtilis. (p)ppGpp kuhjumise indutseerimiseks kasutati eeltöötlust muprirotsiiniga. Seejärel lisati uuritav antibiootikum subinhibeerivas kontsentratsioonis. Mõlema bakteriliigi korral pidurdasid kõik testitud translatsiooni inhibiitorid (p)ppGpp kuhjumist.
Meie uurimisrühma bioinformaatiline analüüs tuvastas, et mõnedes bakteriliikides on RSH ensüümid, millel on ainult (p)ppGpp sünteesi eest vastutav osa. Leiti, et selline ensüüm bakteris Cellulomonas marina võib fosforüleerida ka adenosiini, tekitades molekuli ppApp. Koos paralleelselt ilmunud töödega teistest laboritest on alust arvata, et tegemist on uudse regulaatornukleotiidiga. Selle nukleotiidi täpse rolli kindlakstegemine nõuab edasisi uuringuid.